AMBITUS rendszer rágcsálók aktivitási és kognitív funkcióinak vizsgálatára

 

Kulcsszavak: magatartás vizsgálatok, memória, motiváció, motoros aktivitás, mozgás érzékelés, patkány, rágcsálók, szoftver, tanulás

 

Bevezetés

A tanulás/memória folyamatok egészséges működése számos agyi központ kooperációját követeli meg (Vorhees and Williams, 2014;Buzsaki, 2013), melyek zavara igen sokféle neuropszichiátriai megbetegedéshez vezethet. Mind a hatásmechanizmusok felderítéséhez, mind új gyógyszerek teszteléséhez a preklinikai kísérletek elengedhetetlenek. A PubMed adatai szerint a tanulási képességet rágcsálókban vizsgáló tanulmányok száma fokozatosan nőtt az elmúlt 20 év során (1. ábra).

1. ábra. A tanulási képességet vizsgáló tanulmányok számának alakulása rágcsálókban (A) illetve útvesztő patkányokban (B) 2000-2018-ig.

Számos módszer áll rendelkezésünkre, melyekkel vizsgálhatjuk rágcsálók tanulás képességét. Ezen tesztek nagyrésze büntetésen alapul, és kevés az olyan teszt, (pl. új tárgy felismerési-, lyukas-tábla tesztek, útvesztők), melyben a feladat jutalmazáshoz vagy az állatok természetes érdeklődéséhez kapcsolható  (Bevins and Besheer, 2006; Casarrubea et al., 2010; Chambon et al., 2011; Chrobal et al., 1987; Fitzgerald et al., 1985; Gordan et al., 2012; Hauser et al., 2012; Kekesi et al., 2015; Locklear and Kritzer, 2014; McLean et al., 2009; Petrovszki et al., 2013; Roof and Stein, 2001; Schroeder et al., 2000; van der Staay et al., 2012; Vorhees and Williams, 2014; Xu et al., 2013).

Nagyon fontos ezen viselkedést tanulmányozó tesztekben, hogy a kísérleti körülmények hasonlítsanak az állat természetes környezetéhez, és a kapott feladatot meg is tudja oldani relatíve rövid időn belül (Heim et al., 2000). Jól ismert, hogy a rágcsálók a szűk folyosókat preferálják a nyílt térrel ellentétben (Kimchi and Terkel, 2004). A lyukas tábla tesztben nyílt téren kell az állatnak 16-25 a padlóba mélyesztett lyukból összeszednie a jutalmat. A patkány által preferált szűk járatot szimulálják az útvesztők illetve a körkörös folyosók (Monaco et al., 2014; Nadal et al., 2005; Newman et al., 2014; Wikenheiser et al., 2013; Wikenheiser and Redish, 2011,2015). Azonban, a korábbi módszerek általában hosszú tanulási periódust igényelnek, illetve sok esetben még nincs megoldva az aktivitási paraméterek automatikus regisztrációja. Amennyiben az aktivitási és kognitív paraméterek jellemzését sok állaton kell elvégezni rutinszerűen, gyors, egyszerű, de megbízható tesztre van szükség. Munkacsoportunk kifejlesztett egy új rendszert (AMBITUS) - a lyukas tábla és a körkörös folyosó tesztek jelentősen módosított kombinációját -, mely lehetővé teszi számos paraméter automatikus regisztrációját. Az AMBITUS latin szó, mely a kolostorok kerengőjét illetve a „körbejárást” jelenti. Az AMBITUS egy derékszög alakú körfolyosó fülkékkel ellátva mind a belső, mind a külső oldalán. A rendszer lehetővé teszi, hogy igen nagy időbeli felbontásban, automatikusan rögzíthessük az állatok lokomotoros és vizsgálódási (explorációs) magatartását a fülkékbe, illetve videófelvétel révén az állatok magatartása megfigyelhető, beleértve a megevett jutalomfalatok számát és annak idejét (Horvath et al., 2017,2019). Eddigi kísérleteink ebben a rendszerben igazolták, hogy egészséges patkányok néhány ismétlés után megtanulják, hogy a fülkékből kell a táplálékot összeszedni, és 5 percig tartó teszt elegendő arra, hogy az állatok nagy része megegye az összes (16 db) jutalomfalatkát. A rendszer alkalmas arra, hogy igen sokféle elrendezésben prezentáljuk a jutalmat, és ennek megfelelően különféle feladatokat taníthatunk be az állatoknak, így számos a kognitív funkcióhoz és  az aktivitáshoz kapcsolható paraméter vizsgálható az eszköz és a kifejlesztett szoftver révén.

 

Az AMBITUS rendszer részletes leírása

A derékszögű folyosó rendszer fala átlátszó plexiüvegből készül, a külső átmérő 80 cm, a magassága 50 cm és a folyosó szélessége 8 cm (2. ábra). Az aljzat fekete bútorlapból készült. A folyosót kívülről fekete dobozba zártuk, illetve a közepébe fekete tetraédert rögzítettünk, hogy az állatot ne zavarja a külső környezet és az ellenoldali folyosó. Az állat szabadon körbejárhatja a folyosót, de az két szemben levő oldalon lezárható feladattól függően (2B. ábra). Minden falban (4 belső és 4 külső) 2-2 (tehát összesen 16 db) egymástól egyenlő távolságra elhelyezkedő oldalfülkék vannak (5x5x5 cm), melybe a jutalomfalatkákat (20 mg/db) lehet elhelyezni. Minden fülkét valamint a négy folyosó közepét infravörös LED lámpával láttuk el az egyik oldalán, és egy fotocellát a másik oldalán, így az állat által történő fénysugár megszakítása megbízhatóan regisztrálható. A 20 fotocella egységet mikrokontrolleres adatgyűjtőn keresztül számítógéppel összekapcsoltuk,  így a rendszer automatikusan regisztrálja minden egyes fülkében és a folyosókon a fénysugár megszakítását 1 ms-os időbeli feloldással, és tárolja az információt. Program segítségével mind az állat lokomotoros aktivitását, mind a fülkékbe irányuló vizsgálódása szempontjából annak helyét, sorrendjét, időtartamát, látenciáját meghatározhatjuk. Az állatok magatartását a kísérlet alatt infravörös videó felvételre alkalmas eszközzel rögzítjük. A vizsgálat végén illetve a videofelvétel segítségével meghatározható az elfogyasztott jutalomfalat száma, illetve hogy mikor fogyasztotta el az összes jutalmat. Mindezek a paraméterek alkalmasak arra, hogy több az aktivitáshoz és a kognitív funkciókhoz kapcsolható értéket meghatározhassunk (Horvath et al., 2017). A jelenlegi program segítségével közel 100 paraméter rögzíthető illetve származhatő (néhány példa az 1. táblázatban került feltüntetésre), melyek alkalmasak a lokomotoros és explorációs aktivitás, a motiváció, figyelmi funkciók, a tanulási képesség és plaszticitás meghatározására.

2. ábra. Az AMBITUS alaprajza méretekkel nyitott (A) illetve egy lezárt (B) folyósóval  és fényképe (C,D).

1. táblázat.  Néhány példa a program segítségével mérhető illetve kalkulálható paraméterekre a belső és külső fülkékre vonatkozóan, a jutalom elfogyasztásáig és utána, külön-külön, illetve összesítve.

 

Példa tanulási tesztekre az AMBITUS rendszerben

Nagyon sokféle protokoll valósítható meg ebben a rendszerben. A 3. ábrán egy 5 fázisból és 4 féle feladatból álló kísérletsorozatot tüntettünk fel. Az 1. feladatban (T1, zöld vonal) minden fülkében 1-1 jutalom (T1), a 2. feladatban (T2, piros vonal) csak a belső fülkékbe, a 3. feladatban (T2, kék vonal) csak a külső fülkékbe került jutalom.  A 4. feladat során felhelyeztük a I. folyosóba az elválasztó kaput (2B. ábra), és csak a 16. fülkébe került 5 db jutalmat. Az állatokat minden esetben 2*5 perces időtartamot töltöttek a folyosóban 1 perc szünettel a két mérés között, melyet vagy csak a következő napon ismétlünk (-1. pre-fázis), vagy az első két mérés után 3 órával (1-4. fázisok).  

Ez a vizsgálatsorozat alkalmas egyrészt annak kimutatására, hogy egy állat hogyan tud elsajátítani egy egyszerű feladatot, majd pedig annak módosításával, hogyan tud alkalmazkodni az új feladathoz. Ennek megfelelően, az 1. fázisban az T1 feladatot 3 napon keresztül prezentáljuk, tehát az állatok 12 alkalommal kerülnek szembe ezzel a feladattal. A következő 4 napon csak a belső fülkékben található jutalom. Eddigi adataink azt igazolták, hogy az egészséges állatok igen gyorsan képesek megtanulni egy feladatot ebben a rendszerben, illetve egy szkizofrénia állatmodell jelentős eltérést mutatott a kontroll állatokhoz képest (Horvath et al., 2017, 2019). Mindezek az eredmények azt bizonyítják, hogy a készülék valóban alkalmas lehet a kognitív és aktivitási paraméterekben való jelentős eltérések kimutatására, így új gyógyszerek tesztelésére is.

 

Fontosabb jellemzők, melyek előnyt jelenthetnek a korábbi módszerekhez képest

Ez a módszer számos olyan hátrányt kiküszöböl, mely a korábbi tesztekben kifejezésre jutott:

   1, Ez a rendszer nem büntet, hanem jutalmaz.

   2, Igen sokféle protokoll alkalmazható.

   3, A paradigma változtatásával a tanulási plaszticitás is vizsgálható.

   4, Water maze teszt egy fürdetéshez kapcsolt módszer, mely igen jelentős stresszt jelent az állatok számára. AMBITUSban nincs vízhez kapcsolható stressz.

   5, A lyukastábla tesztet nyílt térben végzik, mely szintén jelentős stresszel jár, illetve a jutalmat tartalmazó fülkék az aljzat vannak, ami megnehezíti a beszaglások automatikus regisztrációját. Az AMBITUSban a folyosóban való haladás kisebb stressz az állat számára.

   6, Az egocentrikus tanulás vizsgálatára alkalmas módszer

   7, Számos útvesztőben csak 1-2 jutalom van, így a véletlennek nagyobb szerepe van a feladat teljesítésében. A sok (maximum 16) fülke növeli a valószínűségét, hogy az állat hamarabb megtanulja a feladatot.

   8, A komplikált labirintus illetve képernyőérintős tesztek sokszor nagyon nehéz feladatot jelentenek a rágcsálóknak, ezért a betanítás sokszor heteket vesz igénybe. Az AMBITUS-ben már 2-4 ismétlés során megtanulják az állatok a feladatot.

   9, Videofelvételeken történt magatartás analízis vizsgálat automatikus analízise egyrészt megfelelő kontrasztot és felbontást igényel, továbbá igen bonyolult programozást. Ez ebben a rendszerben nem jelent problémát, mivel az adatok nagyrésze a mozgásérzékelőkből származik.

  10,Számos adatot automatikusan rögzít a rendszer, melyeket a továbbiakban lehet analizálni.

  11, Az adat filéket egy újonnan kifejlesztett szoftver analizálja, és az eredmény spreadsheet file-ban elérhető.

  12, Lehetőséget nyújt nagyszámú állat gyors megbízható vizsgálatára rövid időperiódus alatt.

 

HASZNOSÍTÁS

Különféle farmakonok toxikológiai illetve számos betegségre kifejlesztett állatmodellek kiértékelése szempontjából sokszor szükség van arra, hogy gyorsan és megbízhatóan kiértékeljük nagyszámú állat aktivitását illetve kognitív funkcióit. Ugyanakkor, a tesztek hosszútávú ismétlése alkalmas a memória korral történő romlásának kimutatására, többféle paradigma bevezetése a tesztek során segíthet feltérképezni a központi idegrendszer plaszticitását is. A kifejlesztett új rendszer az eddigi, nemzetközi folyóiratokban publikált eredmények alapján azt igazolta, hogy ezek a funkciók, illetve ehhez kapcsolódóan számos paraméter gyorsan és megbízhatóan detektálható patkányokban. Mindezek alapján, mivel nemzetközi tudományos folyóiratokból is megismerhető ez a módszer.

 

Szeged, 2020. január 23.

 

 

Irodalomjegyzék

Bevins,R.A., Besheer,J., 2006. Object recognition in rats and mice: a one-trial non-matching-to-sample learning task to study 'recognition memory'. Nat. Protoc. 1, 1306-1311.

Buzsaki,G., 2013. Time,space and memory. Nature 497, 568-569.

Casarrubea,M., Sorbera,F., Magnusson,M., Crescimanno,G., 2010. Temporal patterns analysis of rat behavior in hole-board. Behav. Brain Res. 208, 124-131.

Chambon,C., Wegener,N., Gravius,A., Danysz,W., 2011. A new automated method to assess the rat recognition memory: validation of the method. Behav. Brain Res. 222, 151-157.

Chrobal,J.J., Hanin,I., Walsh,J.T., 1987. AF64A (ethylcholine aziridinium ion), a cholinergic neurotoxin, selectively impairs working memory in a multiple component T-maze task. Brain Res. 414, 15-21.

Fitzgerald,R.E., Rosenberg,I.E., Oettinger,R., Battig,K., 1985. Maze patrolling by rats with and without food reward. Anim. Learn. Behav. 13(4), 451-462.

Gordan,M.L., Jungwirth,B., Ohl,F., Kellermann,K., Kochs,E.F., Blobner,M., 2012. Evaluation of neurobehavioral deficits following different severities of cerebral ischemia in rats: a comparison between the modified hole board test and the Morris water maze test. Behav. Brain Res. 235, 7-20.

Hauser,J., Sontag,T.A., Tucha,O., Lange,K., 2012. The effects of the neurotoxin DSP4 on spatial learning and memory in Wistar rats. ADHD Atten Def Hyp Disord 4, 93-99.

Heim,C., Pardowitz,I., Sieklucka,M., Kolasiewicz,W., Sontag,T., Sontag,K.H., 2000. The analysis system COGITAT for the study of cognitive deficiencies in rodents. Behav. Res. Methods Instrum. Comput. 32, 140-156.

Horvath,G., Liszli, P., Kekesi,G., Buki, A., Benedek, G. 2017. Characterization of exploratory activity and learning ability of healthy and "schizophrenia-like" rats in a square corridor system (AMBITUS). Physiol. Behav. 169:155-64.

Horvath,G., Liszli, P., Kekesi,G., Buki, A., Benedek, G. 2019. Cognitive training improves the disturbed behavioral architecture of schizophrenia-like rats, "Wisket". Physiol. Behav. 201:70-82.

Kekesi,G., Petrovszki,Z., Benedek,G., Horvath,G., 2015. Sex-specific alterations in behavioral and cognitive functions in a "three hit" animal model of schizophrenia. Behav. Brain Res. 284, 85-93.

Kimchi,T., Terkel,J., 2004. Comparison of the role of somatosensory stimuli in maze learning in a blind subterranean rodent and a sighted surface-dwelling rodent. Behav. Brain Res. 153, 389-395.

Locklear,M.N., Kritzer,M.F., 2014. Assessment of the effects of sex and sex hormones on spatial cognition in adult rats using the Barnes maze. Horm. Behav. 66, 298-308.

McLean,S.L., Woolley,M.L., Neill,J.C., 2009. Effects of subchronic phencyclidine on behaviour of female rats on the elevated plus maze and open field. J. Psychopharmacol. 1-4.

Monaco,J.D., Rao,G., Roth,E.D., Knierim,J.J., 2014. Attentive scanning behavior drives one-trial potentiation of hippocampal place fields. Nat. Neurosci. 17, 725-731.

Nadal,R., Rotllaant,D., Marquez,C., Armario,A., 2005. Perseverance of exploration in novel environments predicts morphine place conditioning in rats. Behav. Brain Res. 165, 72-79.

Newman,E.L., Climer,J.R., Hasselmo,M.E., 2014. Grid cell spatial tuning reduced following systemic muscarinic receptor blockade. Hippocampus 24, 643-655.

Petrovszki,Z., Adam,G., Tuboly,G., Kekesi,G., Benedek,G., Keri,S., Horvath,G., 2013. Characterization of gene-environment interactions by behavioral profiling of selectively bred rats: the effect of NMDA receptor inhibition and social isolation. Behav. Brain Res. 240, 134-145.

Roof,R.L., Stein,D.G., 2001. Gender differences in Morris water maze performance depend on task parameters. Physiol. Behav. 68, 81-86.

Schroeder,U., Schroeder,H., Schwegler,H., Sabel,B.A., 2000. Neuroleptics ameliorate phencyclidine-induced impairments of short-term memory. Br. J. Pharmacol. 130, 33-40.

van der Staay,F.J., Gieling,E.T., Pinzón,N.E., Nordquist,R.E., Ohl,F., 2012. The appetitively motivated cognitive holeboard: a family of complex spatial discrimination tasks for assessing learning and memory. Neurosci. Biobehav. Rev. 36, 379-403.

Vorhees,C.V., Williams,M.T., 2014. Assessing spatial learning and memory in rodents. ILAR Journal 55, 310-332.

Wikenheiser,A.M., Redish,A.D., 2011. Changes in reward contingency modulate the trial-to-trial variability of hippocampal place cells. J. Neurophysiol. 106, 589-598.

Wikenheiser,A.M., Redish,A.D., 2015. Hippocampal theta sequences reflect current goals. Nat. Neurosci. 18, 289-294.

Wikenheiser,A.M., Stephens,D.W., Redish,A.D., 2013. Subjective costs drive overly patient foraging strategies in rats on an intertemporal foraging task. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 110, 8308-8313.

Xu,R.X., Grigoryev,N., Li,T.L., Bian,H.S., Zhang,R., Liu,X.Y., 2013. Development of hexagonal maze procedure for evaluating memory in rat. Biomed. Rep. 1, 134-138.